In order to accomplish swine influenza virus isolation, 10 tissue lung samples were selected from 49 real time RT-PCR positive samples. Lung homogenate sample were inoculated into 10 day old chicken eggs. Four viral isolates were obtained from the 10 samples selected. Three swine influenza virus isolates obtained were subtyped as pandemic influenza A virus H1N1. This study is the first report of swine influenza isolation in Cuban swine farms.

Con el fin de realizar el aislamiento del virus de la influenza, porcina se seleccionaron 10 muestras de tejido pulmonar de un total de 49 que resultaron positivas por RT-PCR en tiempo real. El aislamiento se realizó en embriones de pollo con resultados positivos en 4 de las 10 muestras inoculadas. De estas cuatro muestras tres fueron identificadas como virus de influenza pandémicos (H1N1). Los resultados de este trabajo constituyen el primer reporte de aislamiento del virus de influenza porcina en las poblaciones de cerdos de Cuba.

Avian influenza virus causes infection, disease and death on different bird species and has also acquired the capability of transmiting from avian species to humans and other mammals causing severe diseases. For that reason, there is a great international concern on avian influenza virus detection and diagnostic strategies. Although conventional laboratory methods used for isolation and identification of the virus and for detection of specific antibodies continued to be widely applied, new technologies have been rapidly developed. With the use of molecular tools detection, pathotyping, and phylogenetic characterization of influenza A viruses obtained from clinical specimens can be done on the some day.

El virus de la influenza aviar provoca infección, enfermedad y muerte en diferentes especies de aves, además ha adquirido la capacidad de propagarse del hospedador aviar a humanos y otros mamíferos, provocando una enfermedad grave. Por ese motivo, existe una gran preocupación a nivel internacional en la detección del virus de la influenza aviar y las estrategias de diagnóstico. A pesar que los métodos de laboratorios convencionales son ampliamente usados para el aislamiento e identificación de los virus y para la detección de anticuerpos específicos en todo el mundo, nuevas tecnologías han sido rápidamente desarrolladas. Con el empleo de las herramientas moleculares se puede realizar en un mismo día de la detección, patotipificación y caracterización filogenética de los virus de influenza obtenidos a partir muestras clínicas.

Encephalomyocarditis virus (EMCV) infections can cause losses in pig farms all over the world. Rapid, sensitive and unequivocal detection of this virus is therefore essential for the diagnosis and control of the disease. An RT-PCR assay was developed, optimized and evaluated for encephalomyocarditis virus detection in organ based on a pair of primers that amplifies a 165 bp DNA fragment from a highly conserved nucleotide region of the viral 3D glycoprotein. PCR products of the expected size were obtained from Cuban EMCV 744/03 strain. Non-specific reactions were not observed when other porcine RNA genome viruses and uninfected cells were used. The analytical sensitivity of the test was estimated to be 2 TCID50/50 mL. The analysis of tissue homogenate samples from naturally infected animals proved the potential usefulness of the method for a rapid disease diagnosis from field cases.

Porcine circovirus 2 is nowadays accepted as the essential infectious agent of postweaning multisystemic wasting syndrome which causes severe economic losses in porcine production worldwide. The diagnosis of PMWS is a difficult task and must follow three criteria: (i) the presence of compatible clinical signs, (ii) the presence of characteristic microscopic histopathological lesions, and (iii) the presence of PCV2 within these lesions in moderate or high. The presence of PCV2 in lymphoid tissues must be demonstrated by in situ hybridization or immunohistochemical methods. The in situ hybridization is a more complex and expense compared to other diagnostic tools, on the other hand, one problem concerning the immunohistochemical methods for PMWS diagnostic is the lack of a commercial anti-PCV2 peroxidase conjugate; therefore, the aim of this work was to obtain a polyclonal-antibody-immunoperoxidase-conjugate for the PCV2 specific detection. An anti-PCV2-peroxidase conjugated for the PCV2 specific detection was obtained based on the use of the available commercial vaccine against PCV2 as immunogenic inoculation for producing a polyclonal antibody in rabbits. The conjugate obtained was able to discriminate between PCV2 and PCV1 infections and a high sensitivity and specificity of the conjugate were observed.

El circovirus porcino 2 (PCV2) se considera actualmente como el agente infeccioso esencial del síndrome del desmedro post-destete (PMWS), el cual causa grandes pérdidas económicas en la producción porcina de todo el mundo. El diagnóstico del PMWS es difícil y debe seguir tres criterios: (i) la presencia de signos clínicos compatibles, (ii) la presencia de lesiones histopatológicas microscópicas características y (iii) la presencia de cantidades moderadas o altas del PCV2 dentro de las lesiones. La presencia de PCV2 en los tejidos linfoides se debe demostrar por hibridación in situ o métodos inmunohistoquímicos. La hibridación in situ es un método más complejo y costoso comparado con otras herramientas diagnósticas, por otra parte, un problema con relación a los métodos inmunohistoquímicos para el diagnóstico de PMWS es la carencia de un conjugado con peroxidasa comercial específico contra PCV2, por lo tanto el objetivo de este trabajo fue obtener un anticuerpo policlonal conjugado con peroxidasa par la detección específica de PCV2. Se obtuvo un conjugado con peroxidasa para la detección específica de PCV2 con el uso de una vacuna contra PCV2 disponible comercialmente como inmunogéno en conejos con el fin de obtener el anticuerpo policlonal contra PCV2. El conjugado obtenido fue capaz de discriminar la infección por PCV2 de la infección por PCV1, y mostró elevadas sensibilidad y especificidad.

To obtain information about the porcine parvovirus (PPV) infection status of pigs in Cuba, tissue samples collected from ill pigs were evaluated using polymerase chain reaction (PCR). The PCR analysis showed the presence of PPV in 12 of the 34 (35.3%) field clinical samples assessed. Pigs from three of the seven swine herds of six different geographic regions were detected to be positive for PPV. A field PPV strain was isolated for the first time in the country. A swine herd showed 57 of 60 sera sampled (95%) positive for PPV specific antibodies by a commercial ELISA. This study is the first report of PPV infecting pigs in Cuban swine herds.

Con el fin de conocer el estatus de infección por parvovirus porcino (PPV) de cerdos en Cuba, se colectaron muestras de órganos de cerdos para su evaluación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El análisis de PCR mostró la presencia de infecciones por PPV en 12 de las 34 (35.3%) muestras clínicas de campo evaluadas. Se detectaron como positivos a PPV tres rebaños porcinos del total de siete evaluados pertenecientes a seis diferentes regiones geográficas del país. Se aisló PPV de una muestra clínica de campo por primera vez en el país. Un rebaño porcino mostró 57 de 60 muestras (95%) como positivas para anticuerpos a PPV por un ELISA comercial. Este estudio constituye el primer reporte de PPV infectando cerdos en rebaños porcinos en Cuba.

Avian influenza is a great threat for animal and human health, thus strengthening diagnostic systems against probable outbreaks is a priority all over the world. That is why detection is important by the use of molecular methods (RT-PCR and Real Time RT-PCR) due to their high speed, sensitivity and specificity allowing to take control measures in order to avoid the dissemination of the agent. In this work, the obtaining and evaluation of amplification and quantification positive controls for RT-PCR and Real Time RT-PCR (RRT-PCR) have been described. They were obtained from the cloning of two PCR products, one of them corresponding to a region of the subtype H5 hemagglutinin gene and the other to the matrix gene (M) for Influenza type A. The primers were selected keeping in mind that the PCR products included the corresponding regions of H5 and influenza type A primer couples reported by RT-PCR and RRT-PCR of OIE/ FAO reference laboratories for the diagnosis of this disease. From an RNA extracted from H5N2 strain (kindly donated by the OIE reference laboratory for avian influenza), the cDNA used as a mold for the amplification with the primers J3/J1C for H5 subtype and M2 M+25 for Influenza type A, recommended by reference laboratories, was obtained. A clone from which a fragment of the size expected was amplified, was selected as a positive control in the detection assays of nucleic acids for the H5 subtype and influenza A type. Also, the H5 plasmid was evaluated for RRT-PCR and a standard curve with a Ct of 15 was obtained. The amplification control obtained for H5 subtype detection will allow to standardize assays and evaluate possible negative falses for the quick detection of this subtype in Cuba; and in the case of the positive control for influenza type A it will be used for quantification in RRT-PCR assays.

La influenza aviar (IA) constituye una gran amenaza para la salud animal y humana por lo que es una prioridad a nivel mundial el fortalecimiento de los sistemas de diagnóstico frente a probables brotes, de ahí la importancia de la detección por métodos moleculares (RT-PCR y Real time RT-PCR) por su elevada rapidez, sensibilidad y especificidad de estos que permiten tomar las medidas de control para evitar la diseminación del agente. En este trabajo se describe la obtención y evaluación de controles positivos de amplificación y cuantificación para RT-PCR y Real time RT-PCR (RRT-PCR) obtenidos a partir del clonaje de dos productos de PCR, uno correspondiente a una región del gen de la hemaglutinina del subtipo H5 y el otro al gen de la matriz (M) para Influenza tipo A. Los cebadores se seleccionaron teniendo en cuenta que los productos de PCR incluyeran las regiones correspondientes de parejas de cebadores de H5 e influenza tipo A reportados tanto por RT-PCR y RRT-PCR de laboratorios de referencia de la OIE/FAO para el diagnóstico de esta enfermedad. De un RNA extraído a partir de la cepa H5N2 (gentilmente donado por el laboratorio de referencia para Influenza aviar de la OIE) se obtuvo el cDNA que se utilizó como molde para la amplificación con los cebadores J3/J1C para H5 y M2/M+25 para Influenza tipo A, recomendados por laboratorios de referencia. Se seleccionó un clón a partir del cual se logró amplificar un fragmento de la talla esperada, que se ha utilizado como control positivo en los ensayos de detección de ácidos nucleicos para el subtipo H5 y para influenza tipo A. Además, el plásmido de H5 se evaluó por RRT-PCR y se obtuvo una curva estándar con un Ct de 15. El control de amplificación obtenido para la detección del subtipo H5 permitirá estandarizar los ensayos y evaluar posibles falsos negativos para la detección rápida de este subtipo en Cuba y en el caso del control positivo de influenza tipo A se podrá usar para cuantificación en ensayos de RRT-PCR.

Avian leukosis viruses (ALV) provoke a variety of trasmissible bening and malign tumoral diseases affecting birds. Chickens are affected by six subgroups of ALV designs A, B, C, D, E and J of more recent world dissemination. These viruses are potential contaminants of live vaccines used in poultry. In order to research the presence of DNA from ALVs as contaminants of viral commercial vaccines to be used in poultry, different Marek´s disease vaccines were screened by a reported polymerase chain reaction (PCR) assay designed to detect all subgroups of ALVs. DNA samples extracted from seven vaccines were submitted to PCR using primers for a conserved region of env gene of HPRS-103. ALV sequences were detected in seven samples (100%). The methodology employed proved to be useful for the detection of ALVs as contaminants of imported Marek´s disease vaccines. These data suggest a high occurrence of ALVs in commercial vaccines intended for poultry disease prevention.

Los virus de la leucosis aviar (ALV) provocan una variedad de enfermedades tumorales benignas y malignas transmisibles que afectan a las aves. Los pollos son afectados por seis subgrupos de ALV designados A, B, C, D, E y J de más reciente diseminación mundial. Estos virus son, además, potenciales contaminantes de vacunas vivas usadas en la avicultura. Para investigar la presencia de ADN de ALV como contaminante de vacunas virales comerciales usadas en la avicultura, monitoreamos diferentes vacunas de la enfermedad de Marek en un ensayo reportado por Reacción de la Cadena de la Polimerasa (PCR) diseñado para detectar todos los subgrupos del ALV. Las muestras de ADN extraídas de siete vacunas fueron evaluadas por PCR utilizando cebadores para una región conservada del gen de la envoltura (env) de HPRS-103. Las secuencias del ALV fueron detectadas en las siete muestras (100%). La metodología empleada resultó útil para la detección de ALV como contaminante de vacunas de Marek importadas. Nuestros datos sugieren una elevada presencia de ALV en vacunas comerciales destinadas a la prevención de enfermedad en la avicultura.

Pestivirus genus of the family Flaviviridae includes different viral species that cause significant losses to the livestock industry worldwide affecting cattle, sheep, goats and pigs. A rapid, sensitive, and specific detection of these agents is therefore essential for diagnosis and control of the viral infections. An RT-PCR assay was developed and standardized for the specific panpestivirus detection in serum based on a generic pair of primers that amplifies a 119 pb DNA fragment from a highly conserved region in the 5´-UTR RNA genome. The RT-PCR assay showed to be a specific, rapid, sensitive and highly repeatable purpose.

El género Pestivirus de la familia Flaviviridae incluye diferentes especies virales que causan pérdidas importantes a la industria ganadera en todo el mundo afectando bovino, ovino/caprinos y cerdos. La detección rápida, sensible y específica de estos agentes es por lo tanto esencial para el diagnóstico y control de estas infecciones virales. Se desarrolló y estandarizó un ensayo de RT-PCR para la detección específica de pestivirus en suero basado en una pareja de cebadores que amplifica un fragmento de 119 pb de una región altamente conservada en el extremo 5´UTR del genoma ARN del virus. Este ensayo mostró ser propósito específico, sensible y altamente repetible.

The development of a wide-spectrum antiviral drug against pathogenic coronavirus is nowadays a attractive prospect and may provide an effective first line of defense against emerging CoV-related diseases. The most attractive target for the design of anticoronaviral inhibitors is the main protease or 3CL PRO. Ligand docking and screening algorithms are now frequently used in the drug-design process. The aim of this work based on a validation study of scoring functions is to find a consensus function or to select the scoring function that better predicts the orientation of the ligand in the pocket binding site, in order to perform a virtual screening in ligand databases, with a lower computational cost in the intent of finding a leader compound for antiviral drug against coronaviruses. For this purpose, the scoring functions were implemented within the Dock4.0 program suite and the 2ALV main protease three dimensional structures will be used. The protein structure was selected because it was crystallized with a non-peptidic ligand. The main protease coronavirus pocket including the catalytic dyad Cys145 His41 was obtained. The closer RSMD media values to 4.0 Aº were obtained using the contact score function from the rigid ligand dock method. This score function was selected as the best ranking tool for the search based on virtual screening of the potential candidate inhibitors of the important pathogen group belonging to the genus coronavirus.

El desarrollo de fármacos antivirales de amplio espectro que se puedan utilizar contra diferentes patógenos emergentes del género coronavirus como primera línea de defensa es hoy una perspectiva atractiva. La proteasa principal de los coronavirus 3CL PRO es la diana de mayor atractivo para el diseño de inhibidores anticoronavirus. Los algoritmos de screening y docking son actualmente muy utilizados en los procesos de diseño racional de fármacos. El objetivo de este trabajo es, basados en un estudio de validación de las funciones de score, encontrar una función consenso o seleccionar la función de score que mejor prediga la orientación del ligando en el bolsillo catalítico de la 3CLpro, con el fin de mejorar las búsqueda por screening virtual en las bases de datos de ligandos, compuestos que puedan servir de líderes como candidatos a usarse como fármacos inhibidores anticoronavirus, con un menor costo computacional. Con este propósito se utilizaron las funciones de score implentadas en el paquete de programas del DOCK4.0 y la estructura cristalizada de la 3CLpro 2ALV, esta última se seleccionó por estar cristalizada con un ligando de naturaleza no peptídica. Se diseñó el bolsillo catalítico de la proteasa principal de coronavirus que incluyó los residuos que conforman la díada catalítica Cys145 His41. La función con la cual se obtuvieron los mejores valores de RSMD más cercanos a 4.0Aº, fue la función de contacto, siguiendo un algoritmo de orientación de ligando rígido, esta función se seleccionó como la mejor herramienta en la puntuación de búsquedas basadas en screening virtual de candidatos potenciales como inhibidores del importante grupo de patógenos del género coronavirus.

"Margarita" CSF virus isolate (Cuba, 1958) was characterized from the antigenic, biological and molecular point of view; adapted on PK-15 and SK-6 cell lines with an infective titer of 10(7.5) DICT50, and biologically cloned by limit dilution keeping its pathogenicity in pigs. Genotyping of this virus was made and its phylogenetic relationship with another strain deposited at the GenBank was determined keeping located in the 1.2 sub-group very close related with the field isolates from the 1993-2006 epidemic in Cuba. Its antigenic behavior was similar to the "Alfort" strain, showing no reactivity to MAbss against vaccine strains. The complete sequence of the gene for the E2 protein deposited in the EMBL with number AJ704817 is shown, also the a.a. deduced sequence showing all the residues of cysteine highly conserved in the pestivirus genome is given being part of the different types of conformational epitopes of the glycoprotein E2. From these results, an isolate of a Cuban-native CSF virus fully characterized is available, which can be used as reference material for several purposes.

Con el objetivo de disponer de una cepa como material de referencia de Peste Porcina Clásica (PPC) se realizó la caracterización desde el punto de vista antigénico, biológico y molecular del aislado "Margarita" (La Habana, 1958) del virus de la PPC mantenido en cerdos. Se adaptó al crecimiento en células PK-15 y SK-6 con un título infectivo de 10(7.5) DICT50, se clonó biológicamente por dilución límite manteniendo su patogenicidad para el cerdo. Se realizaron estudios filogenéticos con otras cepas informadas en el GenBank quedando ubicada en el sub-grupo 1.2 muy estrechamente relacionada con los aislados de campo de la epizootia cubana desde 1993 hasta la fecha. Se determinó que su comportamiento antigénico es similar al de la cepa "Alfort" y mostró no reactividad frente a anticuerpos monoclonales dirigidos contra cepas vacunales. La secuencia completa del gen que codifica para la proteína E2 fue depositada en el EMBL con número de acceso AJ704817 y se discute la secuencia de aminoácidos deducida, la cual mostró todos los residuos de cisteína que se encuentran altamente conservados en los genomas de los pestivirus y que forman parte de los diferentes epítopos conformacionales de la glicoproteína E2. A partir de los resultados obtenidos se dispone de un aislado autóctono cubano del virus de la PPC completamente caracterizado que sirve como material de referencia para diferentes propósitos.

The design of a Polymerase Chain Reaction (PCR) assay for the detection of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) was described. This one was based on the amplification of a portion of the viral tk gene, for which different concentrations of primers, magnesium chloride and different annealing temperatures were tried. In addition, the parameters of analytical performance, sensitivity and specificity were evaluated with satisfactory results. Under the optimal conditions, the amplification of the band 202 pb expected was obtained, and the utility of the test for the identification of isolates was demonstrated.

Se describe el diseño de un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de herpesvirus bovino tipo 1 (HVB-1). Este se basó en la amplificación de una porción del gen tk viral, para lo cual se ensayaron diferentes concentraciones de los cebadores, de cloruro de magnesio y diferentes temperaturas de alineamiento. Además, se evaluaron los parámetros de desempeño analítico, sensibilidad y especificidad, con resultados satisfactorios. Bajo las condiciones óptimas se logró la amplificación de la banda de 202 pb esperada y se demostró la utilidad del ensayo para la identificación de aislados.